含有抗褪色劑的封固劑——光漂白的解毒劑

什么是抗褪色溶液？

Antifadent 溶液可減少用于標(biāo)記生物物種的染料的光漂白或熒光褪色。熒光染料的褪色是熒光顯微鏡（例如免疫熒光研究）中的一個(gè)特殊問(wèn)題。熒光染料還用作細(xì)胞標(biāo)記物，例如用于跟蹤細(xì)胞中鈣的吸收和釋放，以及用于表征細(xì)胞表面。對(duì)于高放大倍率的工作，可以使用非熒光浸油。

在熒光顯微鏡中，熒光是由高強(qiáng)度紫外線或可見(jiàn)光激發(fā)的。光的吸收形成染料的激發(fā)態(tài)（通常是單線態(tài)），這導(dǎo)致熒光。然而，染料的激發(fā)態(tài)可能會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致其被破壞，如熒光的褪色或漂白以及隨后的圖像丟失或在測(cè)定的情況下，測(cè)量過(guò)程中信號(hào)強(qiáng)度的變化所證明的那樣。

為了克服這些問(wèn)題，當(dāng)通過(guò)熒光顯微鏡或其他檢測(cè)系統(tǒng)檢查標(biāo)本時(shí)，使用抗褪色（抗漂白）溶液作為封固劑，并作為測(cè)定的添加劑。

常用的溶液是 AF1，它是一種包含在甘油 PBS（磷酸鹽緩沖鹽水）溶液中的抗褪色劑（抗漂白劑），對(duì)于檢查組織切片特別有用。

AF2 溶液含有甘油中的抗褪色劑，用戶可以選擇自己的緩沖液，AF3 是 PBS 溶液中的抗褪色劑。 AF3 對(duì)于檢查活細(xì)胞特別有用。

AF87是一種含有抗褪色劑的非熒光浸油。 CFPVOH 是用作固體封固劑的聚（乙烯醇）水溶液。 AF100 是一種抗褪色劑（抗漂白劑）解決方案，當(dāng)固體封固劑中的樣本褪色（漂白）出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，可與 CFPVOH 一起使用。

沒(méi)有一種抗褪色劑是基于對(duì)苯二胺的。所有溶液均可在室溫下儲(chǔ)存。

如何選擇？

這些關(guān)鍵決策因素將幫助您選擇最合適的封固劑：

1. 您需要硬化介質(zhì)還是非硬化介質(zhì)？

2. 如果您的系統(tǒng)具有甘油耐受性，則選擇基于甘油的產(chǎn)品，如果不是，則使用不含甘油的解決方案。

3. 這些高折射率封固劑解決方案適用于您希望消除球差影響（由蓋玻片玻璃和封固劑介質(zhì)的折射率不匹配引起）的情況，該影響會(huì)導(dǎo)致圖像分辨率損失。

   下表說(shuō)明了可用的抗淬滅劑的主要類型。

非硬化封固劑指南

甘油基

• AF1甘油-PBS 溶液含有胺類抗褪劑。

• AF1 plus DAPI 含有胺抗褪色劑和 DNA 染色劑 DAPI。

• AF2 A 甘油溶液含有胺類抗褪劑，可讓您選擇自己的緩沖溶液。

• AF4 沒(méi)食子酸正丙酯的甘油溶液。

基于高折射率甘油的解決方案

這些解決方案的折射率與蓋玻片玻璃的折射率相匹配，從而最大限度地減少球面像差的影響。此類封固劑對(duì)于通過(guò)單多光子共焦利基等技術(shù)對(duì)樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像非常有價(jià)值，因?yàn)樗梢宰鳛橛行У那鍧嵔鉀Q方案（幾分鐘內(nèi)即可發(fā)生清潔 - Sean Speese，俄勒岡健康與州立大學(xué)，個(gè)人通訊）。這些試劑的有益效果可以從下面的兩張圖中看出，可以看出在封固劑溶液內(nèi)的顯著深度處獲得了高分辨率圖像。這些溶液的其他特點(diǎn)包括它們與水的混溶性，它們無(wú)味并且不會(huì)淬滅熒光染料的熒光（與硫代二乙醇不同，另一種建議的高折射率封固劑）并且溶液可以長(zhǎng)期穩(wěn)定（至少 1 年）。

• CFM-1是一種甘油-PBS 緩沖溶液，折射率約為 1.52，可用于透射顯微鏡以及落射熒光顯微鏡。

• CFM-1 plus AF是一種甘油基溶液，折射率約為 1.52（室溫），含有胺類抗褪色劑

• CFM-2是甘油-三胺緩沖溶液，折射率約為 1.52（室溫），pH 值約為 8.5

• CFM-3 – 這種基于甘油的抗褪色劑含有中性 pH 值和折射率約為 1.52 的菲尼克斯抗褪色劑，也可作為透明溶液，使樣品深處的熒光染料可視化。

• CFMR2 –該產(chǎn)品設(shè)計(jì)用于與 GFP 標(biāo)記的樣品一起使用。它含有一種抗褪色劑，不會(huì)使溶液脫氧，如果 GFP 不漂白，這是一個(gè)重要的特性。

不含甘油

• AF3是含有胺基抗褪劑的 PBS 溶液。

• CFPVOH是聚乙烯醇的水溶液。只要注意不要讓水蒸發(fā)，它就會(huì)保持液態(tài)。通過(guò)添加抗褪色劑水溶液 AF100 來(lái)延遲光漂白。

• AF100是胺基抗褪劑的 PBS 溶液，用作 CFPVOH 的添加劑（1 份 AF100 比 9 份 CFPVOH）。只要注意不要讓水蒸發(fā)，它就會(huì)保持液態(tài)。

• AFR3是一種PBS溶液，含有新型非胺、非酚類抗褪劑。

高折射率無(wú)甘油溶液

AF87是一種折射率為 1.52 的浸油，含有抗褪色劑。它可以用作浸油，也可以用作封固劑。由于 AF87 是一種與水不混溶的油，因此在使用封固劑之前必須對(duì)標(biāo)本進(jìn)行脫水。

硬化封固劑指南

硬化封固劑是含有聚合物如聚(乙烯醇)(PVOH)的水溶液。當(dāng)將幾微升這些溶液移至顯微鏡載玻片上并蓋上蓋玻片時(shí)，水會(huì)緩慢蒸發(fā)，并形成穩(wěn)定的薄膜，從而固定蓋玻片。

有多種硬化封固劑可供選擇，可提供具有一定硬度范圍的薄膜。它們基于水溶性聚合物，例如聚（乙烯醇（PVOH）和聚（乙烯基吡咯烷酮）（PVP））。

為什么含有抗褪色劑的 PVOH 甘油水溶液本質(zhì)上不穩(wěn)定？

PVOH 是通過(guò)聚（乙酸乙烯酯）水解產(chǎn)生的，大多數(shù) PVOH 商業(yè)樣品含有殘留（未水解）的乙酸酯基團(tuán)。這些基團(tuán)在儲(chǔ)存過(guò)程中會(huì)發(fā)生水解，通常會(huì)因添加的抗褪色劑而加速水解，這會(huì)導(dǎo)致 pH 值變化，更常見(jiàn)的是凝膠化。

后一個(gè)過(guò)程會(huì)導(dǎo)致不可預(yù)測(cè)的保質(zhì)期。通過(guò)配制含有所需量抗褪色溶液的小體積 PVOH 溶液，您可以獲得成分和性能一致的材料，并更好地利用您購(gòu)買的材料。

甘油基

• AF200是一種含有胺基抗褪劑的甘油溶液。

• AF300是一種含有酚類抗褪劑的甘油溶液。

成膜聚合物解決方案

• Tris-MWL 4-88是一種經(jīng)典、流行的封固劑溶液，基于 Mowiol® 4-88、甘油、水和 Tris-胺緩沖液。水蒸發(fā)后，形成弱至中等強(qiáng)度的薄膜。為了有效減少光漂白，應(yīng)與 AF100、AF200 或 AF300 一起使用。

• CFPVOH是聚乙烯醇的水溶液，設(shè)計(jì)用于與甘油基防褪劑溶液 AF200 或 AF300 一起使用。蒸發(fā)后產(chǎn)生中等硬度的水膜。

不含甘油

• PVP plus 抗褪色劑是含有胺基抗褪色劑的聚（乙烯基吡咯烷酮）水溶液。該溶液可以長(zhǎng)期穩(wěn)定，例如超過(guò)五年。

• CFPVOH plus 抗褪色劑是精心挑選的 PVOH 的水溶液，含有胺基抗褪色劑，保質(zhì)期為 6 個(gè)月。

成膜聚合物解決方案

• CFPVOH是聚乙烯醇的水溶液。通過(guò)添加抗褪色劑水溶液 AF100 來(lái)延遲光漂白。 （1 份 AF100 至 9 份 CFPVOH）