細胞培養(yǎng)物解離是細胞培養(yǎng)物維持的關鍵步驟。它涉及將細胞從其生長表面分離以進行傳代培養(yǎng)或收獲。本節(jié)概述了兩種主要方法：使用無酶解離緩沖液和使用酶試劑。

1. 使用無酶細胞解離緩沖液

該方法非常溫和，無需使用酶即可保持細胞完整性：

1. 準備

• 確保所有試劑在使用前加熱至 37°C，以避免對細胞造成沖擊。

2. 去除生長培養(yǎng)基：

• 從培養(yǎng)容器中丟棄舊的生長培養(yǎng)基。

3. 漂洗

• 每個 T75 燒瓶或 100 mm 培養(yǎng)皿用 5 ml 不含鈣和鎂的 PBS 沖洗細胞單層。

• 在室溫下輕輕搖動容器 30 至 60 秒。

• 吸出并丟棄沖洗溶液。

• 再次重復此沖洗步驟。

4. 解離

• 將大約 5 ml 無酶細胞解離緩沖液添加到容器中。

• 在室溫下輕輕搖動 1 至 2 分鐘，然后在顯微鏡下檢查解離情況。

• 如有必要，用手輕敲燒瓶或培養(yǎng)皿以去除細胞。

• 如果細胞貼壁，讓它們在室溫下再靜置 2 至 5 分鐘，并根據需要再次敲擊，使用更多的解離緩沖液。

• 細胞分離后，添加至少 5 ml 全生長培養(yǎng)基以中和解離緩沖液并重懸細胞。

5. 活力檢查

• 在傳代培養(yǎng)過程中監(jiān)測細胞活力，確保其保持在 90% 以上。

2. 使用其他試劑進行解離

該方法允許使用各種解離試劑：

1. 去除用過的介質

• 丟棄培養(yǎng)容器中的舊介質。

2. 洗滌細胞

• 用不含鈣和鎂的平衡鹽溶液清洗細胞，或使用 EDTA。

• 將洗滌液輕輕添加到細胞對面，并搖動容器 1 至 2 分鐘，然后丟棄洗滌液。

3. 解離

• 每 25 平方厘米的生長表面涂抹 2 至 3 毫升所選的解離溶液，確保覆蓋細胞片層。

• 將容器在 37°C 下孵育并輕輕搖動。解離通常發(fā)生在 5 至 15 分鐘內，具體取決于細胞系。

• 對于頑固的細胞，敲擊容器可以加快這一過程。

• 仔細觀察細胞以防止過度暴露和潛在的損壞。

4. 收獲細胞

• 一旦細胞分離，將其直立，讓它們收集在容器底部。

• 添加完整的培養(yǎng)基，然后通過移液到細胞層上分散并收集細胞。

• 計數(shù)并繼續(xù)傳代。

在這兩種方法中，重要的是通過經驗觀察確定每個細胞系的最佳條件。該過程應保留細胞活力，在傳代培養(yǎng)過程中應定期檢查細胞活力是否超過 90%。這些程序為研究人員根據其細胞系的具體要求和特征進行調整奠定了基礎。