熒光顯微鏡：熒光顯微鏡是利用紫外光作為光源照射被檢物體，使其發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀和位置。

熒光顯微鏡用于研究細胞內(nèi)化學物質(zhì)的吸收、運輸、分布和定位。細胞內(nèi)的某些物質(zhì)，如葉綠素，受紫外線照射后能發(fā)出熒光；有些物質(zhì)本身不能發(fā)出熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色，在紫外線照射下也能發(fā)出熒光。對此類物質(zhì)進行定性和定量研究的工具之一。

確認

熒光顯微鏡與普通顯微鏡有以下區(qū)別：
1、照明方式通常為落射照明，即光源通過物鏡投射到樣品上；
2、有兩片特殊濾光片，光源前面的一片用于濾除可見光，目鏡與物鏡之間的一片用于濾除紫外線，保護人眼。
熒光顯微鏡也是光學顯微鏡的一種，主要區(qū)別在于兩者的激發(fā)波長不同。這就決定了熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡在結(jié)構(gòu)和用途上的差異。
熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學的重要工具。它由光源、濾光板系統(tǒng)和光學系統(tǒng)等主要部件組成。它是利用一定波長的光激發(fā)標本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大觀察標本的熒光圖像。

工作準則

光源
多采用200W超高壓汞燈作為光源。它由石英玻璃制成，中間呈球形，里面充有一定量的水銀。工作時，兩個電極之間放電使汞蒸發(fā)，球內(nèi)壓力迅速升高。當汞全蒸發(fā)時，可達到50至70個標準大氣壓，這個過程一般需要5至15分鐘左右。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使汞分子不斷解離還原時發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)出強烈的紫外線和藍紫色光，足以激發(fā)各種熒光物質(zhì)，因此常用于熒光顯微鏡。
超高壓汞燈也會釋放大量的熱能。因此，燈室必須具有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜過高。
新型超高壓汞燈在使用初期無需高壓即可點燃。使用一段時間后，需要用高壓（15000V左右）啟動。啟動后，維持工作電壓一般為50-60V，工作電流為4A左右。 200W超高壓汞燈每次使用2小時，平均壽命約為200小時。因此，使用時盡量減少啟動次數(shù)。燈泡在使用過程中，其光效逐漸降低。燈熄滅后，等待其冷卻后再重新啟動。點亮后不要立即關閉燈泡，以免汞蒸發(fā)不全而損壞電極，一般需要等待15min。由于超高壓汞燈壓力高，紫外線強，燈泡必須放入燈室內(nèi)才能點燃，以免傷眼和爆炸。
超高壓汞燈（100W或200W）的光源電路包括變壓、鎮(zhèn)流器、啟動等幾部分。燈箱上有調(diào)節(jié)燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng)，燈泡燈泡后面安裝有鍍鋁凹面反射鏡，前面安裝有聚光透鏡。

濾色鏡系統(tǒng)
濾色鏡系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要組成部分，由激發(fā)濾光板和壓濾光板組成。濾板的型號、各廠家的名稱往往不統(tǒng)一。濾光板一般以基本色調(diào)來命名，前面的字母代表色調(diào)，后面的字母代表玻璃，數(shù)字代表型號特征。例如德國產(chǎn)品（肖特）BG12是一種藍色玻璃，B是藍色的第一個字母，G是玻璃的第一個字母；有一些廠家的濾板全用數(shù)字命名，如美國康寧廠的濾板。 NO：5-58，相當于BG12。

1.激發(fā)濾光板根據(jù)光源和熒光顏料的特性，可以選擇以下三種類型的激發(fā)濾光板，以提供一定波長范圍內(nèi)的激發(fā)光。
紫外光激發(fā)濾光片：該濾光片可透過400nm以下的紫外光，阻擋400nm以上的可見光通過。常用的型號有UG-1或UG-5，再加一個BG-38來消除紅色尾流。
紫外藍光激發(fā)濾光板：該濾光板可以通過300-450nm范圍內(nèi)的光。常用型號有ZB-2或ZB-3，加上BG-38。
紫藍色激發(fā)濾光片：可通過350～490nm的光。常用型號為QB24（BG12）。
最大吸收峰在500nm以上的熒光素（如羅丹明色素）可以被藍綠色濾光板（如B-7）激發(fā)。
使用金屬膜干涉濾光片。由于其針對性強、波長合適，激發(fā)效果比玻璃濾光片更好。例如西德Leitz工廠的FITC專用KP490濾板和羅丹明的S546綠色濾板都遠遠優(yōu)于玻璃濾板。
激勵濾光片分為薄型和厚型兩種。一般暗視野使用較薄的濾光板，明視場熒光顯微鏡可使用較厚的濾光板。基本要求是獲得最亮的熒光和好的背景。

2、壓制濾光板 壓制濾光板的作用是全阻擋激發(fā)光的通過，并提供相應波長范圍內(nèi)的熒光。與激發(fā)濾光板相對應，常用的有以下三種壓制濾光板：
紫外光壓制濾光板：可透過可見光，阻擋紫外線透過。可與 UG-1 或 UG-5 結(jié)合使用。常用GG-3K430或GG-6K460。
紫藍壓濾板：可通過波長510nm以上（綠至紅）的光，可與BG-12組合使用。通常使用OG-4K510或OG-1K530。
紫外壓制濾光板：可透過波長460nm以上（藍到紅）的光，可與BG-3組合，常用OG-11K470AK 490、K510。

反光罩
反光罩的反射層一般采用鍍鋁，因為鋁在紫外光和可見光的藍紫光區(qū)吸收較少，反射率在90%以上，而銀的反射率只有70%；一般采用平面反射器。

專
為熒光顯微鏡設計的聚光鏡由石英玻璃或其他傳輸紫外線的玻璃制成。有光場聚光鏡和暗場聚光鏡兩種。還有相襯熒光聚光器。
1. 明場聚光鏡 明場聚光鏡常用于一般熒光顯微鏡。聚光能力強，使用方便。特別適合低倍和中倍放大標本的觀察。
2. 暗視野聚光鏡 暗視野聚光鏡越來越多地用于熒光顯微鏡。因為激發(fā)光不直接進入物鏡，除了散射光外，激發(fā)光不進入目鏡。可以使用薄的激發(fā)濾光片來增強激發(fā)光的強度，并且壓濾光片也可以很薄。無色濾光片（無紫外線透射），同時仍產(chǎn)生深色背景。從而增強了熒光圖像的亮度和對比度，提高了圖像質(zhì)量，觀察舒適，并且可以發(fā)現(xiàn)明場中難以區(qū)分的細小熒光顆粒。
3、相襯熒光聚光鏡 相襯聚光鏡與相襯物鏡配合使用，可以同時進行相襯和熒光相結(jié)合的觀察，既可以看到熒光圖像，又可以看到相襯圖像。有助于熒光的準確定位。一般熒光觀察很少需要這種聚光鏡。

物鏡
可以使用多種物鏡，但優(yōu)選消色差物鏡，因為它的自發(fā)熒光最小，并且其透射率（波長范圍）適合熒光。由于顯微鏡視場內(nèi)圖像的熒光亮度與物鏡孔徑比的平方成正比，與其放大倍數(shù)成反比，因此為了提高熒光圖像的亮度，需要采用大孔徑的物鏡。應使用孔徑比。尤其是在高倍放大下，其效果非常明顯。因此，對于熒光不足的標本，應使用大孔徑比的物鏡，目鏡盡可能低（4×、5×、6.3×等）。

目鏡
在熒光顯微鏡中使用低倍目鏡，例如 5× 和 6.3×。過去經(jīng)常使用單目目鏡，因為其亮度是雙目目鏡的兩倍以上，但研究型熒光顯微鏡大多使用雙目目鏡，觀察非常方便。
落射光裝置
新型落射光器件是光源發(fā)出的光照射到干涉分光濾光片后，由于濾光片上涂層的性質(zhì)，短波長部分（紫外線和紫藍色）被反射。當濾光片面向光源時，為45度。傾斜時垂直射向物鏡，然后通過物鏡射向標本，使標本受到激發(fā)，物鏡直接起聚光作用。同時，濾光片的長部分（綠色、黃色、紅色等）對于濾光片來說是透明的。因此，它不會反射向物鏡，并且濾光片充當激發(fā)濾光片。由于標本的熒光處于可見光波長范圍內(nèi)，可以通過濾光片到達目鏡進行觀察，熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)的增加而增加，并且在高放大倍數(shù)下比透射光源更強。除具有透射光源的功能外，更適合直接觀察不透明和半透明標本，如厚片、濾光片、菌落、組織培養(yǎng)標本等。研制的新型熒光顯微鏡大多采用落射光器件，稱為落射熒光顯微鏡。研制的新型熒光顯微鏡大多采用落射光器件，稱為落射熒光顯微鏡。研制的新型熒光顯微鏡大多采用落射光器件，稱為落射熒光顯微鏡。

CCD

簡介
熒光顯微鏡CCD是與熒光顯微鏡密切相關的數(shù)碼相機產(chǎn)品。一方面可以將熒光顯微鏡拍攝的顯微攝影產(chǎn)物通過USB接口傳輸至計算機，方便圖像采集和研究。另一方面，通過熒光顯微鏡CCD我們可以比單獨使用熒光顯微鏡拍攝更好的照片。熒光顯微鏡CCD可與熒光顯微鏡連接構(gòu)成顯微成像系統(tǒng)。

使用范圍
一般情況下，單獨使用熒光顯微鏡就可以達到理想的成像效果，但在某些情況下，比如當熒光比較弱時，單獨使用熒光顯微鏡無法達到理想的拍攝效果，或者我們希望您可以上傳拍攝的照片熒光圖像傳輸至計算機，用于預覽、修改甚至發(fā)表學術論文。這時如果沒有熒光顯微鏡CCD就無法滿足要求。

特點
熒光顯微鏡CCD一般具有良好的弱光捕獲能力，可以捕獲極弱的熒光，因此成像能力良好。另外，不少熒光冷CCD生產(chǎn)公司都對CCD進行了這樣的制冷處理，使得該類CCD的噪聲大大增加。減少，信噪比可以大大提高。由于其方便的應用效果，此類CCD相機廣泛應用于熒光顯微鏡中。

標本制備要求

熒光顯微鏡的標本制備要求
1. 載玻片
載玻片的厚度應在 0.8 至 1.2 毫米之間。一方面，如果坡度太厚，會吸收更多的光，另一方面，激發(fā)光不能集中在標本上。載玻片必須光滑、厚度均勻且無明顯自發(fā)熒光。有時使用石英玻璃載玻片。

2、蓋玻片
蓋玻片厚度約為0.17mm，光滑、潔凈。為了加強激發(fā)光，還可以使用干涉蓋玻片，它是一種特殊的蓋玻片，上面鍍有幾層物質(zhì)（如氟化鎂），這些物質(zhì)對不同波長的光有不同的干涉效果。平滑地通過，同時反射激發(fā)光，該反射的激發(fā)光可以激發(fā)樣本。

3、標本
組織切片或其他標本不宜太厚，太厚則大部分激發(fā)光消耗在標本下部，物鏡直接觀察的上部激發(fā)不夠充分。另外，細胞的重疊或雜質(zhì)的掩蔽也會影響判斷。

4.封固劑
甘油是常用的封固劑。它必須是無色透明且無自發(fā)熒光的。 pH值8.5~9.5時熒光亮度較亮，且不易快速消失。

5、鏡油
一般用暗場熒光顯微鏡和油鏡觀察標本時，必須使用鏡油。最好使用專用的非熒光鏡片油。也可以使用上述的甘油來代替。也可以使用液體石蠟，但折射率較低，圖像質(zhì)量略有影響。影響。

指示

(1)打開光源，超高壓汞燈需要預熱15分鐘才能達到最亮點。
(2)對于透射型熒光顯微鏡，應在光源和暗場聚光鏡之間安裝所需的激發(fā)濾光片，并在物鏡后面安裝相應的壓濾光片。對于落射熒光顯微鏡，需要將所需的激發(fā)濾光片、二色分束器和壓濾光片插入件插入光路中的槽中。
(3)用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置調(diào)節(jié)光源中心，使其位于整個照明光斑的中心。
(4) 放置標本片，調(diào)焦后觀察。使用時應注意：未安裝濾光片時請勿用眼睛直接觀察，以免造成眼睛損傷；用油鏡觀察標本時，必須使用無熒光的專用鏡油；高壓汞燈關閉后，不能立即再次打開，需要等待。水銀燈必須全冷卻后才能重新啟動，否則會不穩(wěn)定，影響水銀燈的壽命。
(5)觀察。例如，在熒光顯微鏡下使用藍紫色濾光片，觀察用0.01%吖啶橙熒光染料染色的細胞，細胞核和細胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光（深綠色和橙紅色）。

防范措施

(1)嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書的要求進行操作，不得隨意改變程序。
(2)檢查應在暗室中進行。進入暗室后，接通電源，點亮超高壓汞燈5-15分鐘。光源發(fā)出的強光穩(wěn)定后，眼睛全適應暗室，然后開始觀察標本。
(3)為防止紫外線對眼睛的傷害，調(diào)節(jié)光源時應戴防護眼鏡。
(4)檢查時間每次以1～2小時為宜。如果超過90分鐘，超高壓汞燈的發(fā)光強度會逐漸下降，熒光也會減弱；標本經(jīng)紫外線照射3～5分鐘后，熒光也會明顯減弱；因此，不應超過2至3小時。
(5)熒光顯微鏡光源的壽命有限，應集中檢查標本，以節(jié)省時間并保護光源。天氣炎熱時，應加風扇降溫，并從更換新燈泡時開始記錄使用時間。燈泡熄滅后想再次使用時，必須等燈泡冷卻后再點亮。應避免每天多次點亮光源。
(6) 染色后立即觀察標本，隨著時間的推移熒光會逐漸減弱。如果將標本保存在4℃的聚乙烯塑料袋中，可以延遲熒光減弱時間，并可以防止封片劑蒸發(fā)。激發(fā)光長期照射標本會引起熒光衰減和消失，因此應盡量縮短照射時間。暫時不觀察時可用遮光罩遮擋激發(fā)光。
(7)觀察標本時應使用非熒光油，并避免眼睛直視紫外光源。
(8)電源應配備穩(wěn)壓器，電壓不穩(wěn)定會降低日光燈的壽命。

熒光顯微鏡與普通顯微鏡有以下區(qū)別：
1、照明方式通常為落射照明，即光源通過物鏡投射到樣品上；
2、光源為紫外光，波長較短，分辨率比普通顯微鏡高；
3、有兩片特殊濾光片，光源前面的一片用于濾除可見光，目鏡與物鏡之間的一片用于濾除紫外線，保護人眼。
熒光顯微鏡也是光學顯微鏡的一種，主要區(qū)別在于兩者的激發(fā)波長不同。這就決定了熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡在結(jié)構(gòu)和用途上的差異。
熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學的重要工具。它由光源、濾光板系統(tǒng)和光學系統(tǒng)等主要部件組成。它是利用一定波長的光激發(fā)標本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大觀察標本的熒光圖像。