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ELISA、免疫 PCR 與 SIMOA：蛋白質檢測工具的比較

更新時間：2023-08-03 點擊次數(shù)：2963

介紹

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）是蛋白質檢測的“金標準"方法。1在本博客中，回顧了三種流行的 ELISA 平臺：標準 ELISA、免疫 PCR和單分子陣列 (SIMOA)。我們將對這些 ELISA 的設計原理、樣本量、儀器和靈敏度進行比較。

ELISA 的工作原理

ELISA的基本設計原理取決于抗體-抗原相互作用的穩(wěn)定性和特異性。簡而言之，固定在珠子或微孔板等固體基質上的捕獲抗體可與多種樣品類型中的目標蛋白結合。此類樣品可包括血漿、血清、細胞和組織裂解物、條件培養(yǎng)基或尿液。

1971 年引入 ELISA 時，酶標記抗原被纖維素顆粒上的抗體捕獲。2然后通過反復離心和洗滌分離抗體-抗原綴合物。此后，不同的 ELISA 格式被開發(fā)出來，包括夾心 ELISA，其中目標蛋白“夾在"捕獲抗體和標記檢測抗體之間（圖 1）。這種 ELISA 格式具有高度特異性，因為需要兩種抗體與蛋白質結合才能進行檢測。此外，可以用標準曲線確定蛋白質濃度（即定量數(shù)據(jù)）。

這里討論的 ELISA 平臺——標準 ELISA、免疫 PCR和單分子陣列 (SIMOA) ——是生成定量數(shù)據(jù)的夾心 ELISA。然而，它們在底物、檢測方法、儀器、樣品體積和靈敏度方面有所不同。

標準酶聯(lián)免疫吸附試驗

標準 ELISA (sELISA) 將捕獲抗體固定到透明塑料 96 孔微孔板上（圖 2、表 1）。該檢測抗體與辣根過氧化物酶 (HRP) 結合，該酶可將其底物 3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 還原為藍色和氧化形式。顏色的變化與 HRP 的量成正比，并且推論與樣品中目標蛋白的量成正比。添加硫酸可終止 HRP-TMB 反應，導致顏色從藍色變?yōu)辄S色。使用酶標儀在 450 nm 處測量吸光度。

	標準	免疫PCR	SIMOA™
基質	96孔微孔板	96孔PCR板	珠子
檢測方法	比色法	聚合酶鏈式反應	熒光
樂器	讀板器	實時熒光定量PCR儀	專用儀器
樣品量*	100微升	10-25 µL	125微升
靈敏度	高的	更高	最高

表 1. 標準 ELISA、免疫 PCR 和單分子陣列 (SIMOA) 的比較。 * = 樣品稀釋后每次重復的最終體積。

sELISA 的靈敏度一般范圍為 1 pg/ml 至 100 pg/ml。然而，一些 sELISA 的定量限 (LLOQ) 低至亞 pg/ml 或高達 10 ng/ml。與所有 ELISA 一樣，靈敏度取決于所用抗體的靈敏度。

對于標準 96 孔板，最終樣品體積為每孔 100 µL。使用“半面積"板可以減少體積 (50 µL) ，其中孔的直徑為一半寬，但測定靈敏度也可能會降低。用于任何ELISA 的原始樣品體積將取決于最佳樣品稀釋度，該稀釋度會因蛋白質、樣品類型和實驗而異。

將樣品添加到板中后，大約 5 小時內即可獲得結果。然而，當樣品和抗體同時添加到板中時，可以實現(xiàn)更快的周轉時間。這減少了孵育步驟和洗滌步驟的數(shù)量。例如，SpeedELISA的處理時間為 3 小時，在添加樣品之前同時孵育板上的捕獲和檢測抗體。其他方法包括一步添加樣品和兩種抗體，或者將樣品和檢測抗體一起添加。然而，減少處理時間會降低靈敏度（圖 3）。

**圖 3. 多步 sELISA 和*SpeedE* LISA 在靈敏度和檢測范圍方面的比較。**針對人 (A) CD26 和 (B) 可溶性 IL-6 受體 (IL-6 sR) 的標準曲線數(shù)據(jù)。兩種測定均使用相同的標準品和抗體對。使用 RayBiotech Life, Inc.（Peachtree Corners，GA；美國）的 sELISA 和 SpeedELISA 試劑盒對人 CD26 和 IL-6 sR 進行分析（CD26：sELISA 試劑盒貨號 ELH-CD26，SpeedELISA 試劑盒貨號 ELHS-CD26）（ IL-6 sR：sELISA 試劑盒目錄號 ELH-IL6sR，SpeedELISA 試劑盒目錄號 ELHS-IL6sR）。 OD = 光密度。

sELISA 的主要優(yōu)點是提供低成本試劑盒，可以針對來自多個物種的數(shù)千種不同蛋白質。此外，sELISA 幾乎不需要培訓，可生成易于解釋的數(shù)據(jù)，并使用與其他檢測兼容的經(jīng)濟實惠的酶標儀。這些優(yōu)點導致 sELISA 在研究中得到廣泛使用。

免疫PCR (IQELISA TM )

免疫 PCR也稱為免疫定量 ELISA (IQELISA)，將捕獲抗體粘附到塑料 96 孔 PCR 板上，同時檢測抗體與 DNA 條形碼綴合（圖 4、表 1）。使用 PCR，雙鏈 (ds) DNA 條形碼在條形碼特異性引物和與 dsDNA 結合的熒光染料存在的情況下分別被擴增和染色。熒光與 dsDNA 的量成正比，因此也與樣品中目標蛋白的量成正比。使用實時 PCR 儀器測量熒光。

IQELISA 的一個優(yōu)點是其體積要求小，每次重復的最終體積僅為 10 µL。因此，當樣品量有限或難以獲得樣品時，IQELISA 是一個特別有吸引力的選擇。然而，IQELISA 比 sELISA 在技術上更具挑戰(zhàn)性，因為它需要更精確的移液。此外，樣品應至少重復三次，因為小體積會增加異常值的機會。

DNA 通過 PCR 擴增循環(huán)呈指數(shù)增長。因此，與使用相同抗原和抗體對的 sELISA 相比，IQELISA 的 LLOQ 平均增加了 23 倍。靈敏度的增加取決于抗體，范圍從無變化到 105 倍（圖 5）。

從樣品孵育到數(shù)據(jù)收集，IQELISA 大約需要 5.5 小時。該周轉時間與 sELISA 類似。

單分子陣列 (SIMOA TM )

SIMOA是一種超靈敏 ELISA，使用抗體包被的珠子和熒光偶聯(lián)的檢測抗體（圖 6、表 1）。將珠子、樣品和檢測抗體混合在一起后，將溶液施加到具有超過 235,000 個微孔的卡盒中。每個微孔只能容納一顆珠子。然后將油添加到卡盒中，將樣品推過微孔陣列的表面并形成孔的液密密封。

使用配備熒光顯微鏡的全自動或半自動系統(tǒng)測量熒光；該儀器由 SIMOA（ Quanterix ；Billerica，MA；美國）開發(fā)商制造。由于每個孔只能包含一個珠子，因此具有熒光的微孔的數(shù)量與樣品中目標蛋白的量成正比。這使得單分子檢測成為可能。

SIMOA 的一個關鍵優(yōu)勢是它可以檢測飛摩爾范圍內的蛋白質。也就是說，靈敏度通常在 10 fg/ml 至 1 pg/ml 范圍內。與 sELISA 和 IQELISA 相比，SIMOA 的平均靈敏度分別提高了 465 倍和 63 倍。

將試劑裝入 Quanterix 儀器后，大約需要 3 小時才能獲取數(shù)據(jù)。因此，SIMOA 的程序時間比 sELISA 和 IQELISA 都短。

雖然 SIMOA 實現(xiàn)了此處評測的三個平臺中的一些最高靈敏度，但該技術也有一些缺點。首先，目前使用該技術分析的蛋白質數(shù)量很少（~165）。其次，SIMOA 試劑盒的成本高于 sELISA 和 IQELISA 試劑盒。第三，檢測儀器價格昂貴，且只能用于SIMOA，是專用儀器，需要專門培訓才能運行。

**圖 7. sELISA 和 SIMOA 在靈敏度和檢測范圍方面的比較。**通過將純化的人**(A)** IL-6 或**(B)** TNA α 添加到緩沖液中生成標準曲線數(shù)據(jù)。 RayBiotech Life, Inc. 的每個靶標的相同標準品和抗體對用于 sELISA 和 SIMOA（IL-6，sELISA 目錄號 ELH-IL6；TNF α，sELISA 目錄號 ELH-TNF）。 Y 軸 = 標準化信號，其中減去空白信號。信號 = sELISA 450 nm 處的 OD 或 SIMOA 的每珠平均酶 (AEB)。空白=不含目標蛋白的緩沖液。

多重ELISA

值得一提的是，IQELISA 和 SIMOA 分別可以同時分析多達 3 個和 6 個目標。除了需要更少的樣品之外，在分析相同數(shù)量的蛋白質時，多重檢測通常比單重檢測更具成本效益。重要的是，多重檢測會降低 IQELISA 的靈敏度，而使用SR-X TM生物標志物檢測系統(tǒng)的SIMOA 則不會影響靈敏度。

還提供其他定量多重 ELISA 選項，包括 Quantibody® 和 RayPlex TM 抗體陣列。Quantibody可以使用 100 µL 稀釋樣品在 6 小時內分析多達 40 種蛋白質，一式四份。使用兼容的激光掃描儀采集數(shù)據(jù)。RayPlex可以使用流式細胞術在 4 小時內每次重復使用 25 µL 稀釋樣品測量多達 25 種蛋白質。兩種抗體陣列的靈敏度與 sELISA 相似。

在我們的博客“使用抗體陣列進行多重蛋白質檢測"或我們的視頻“為您的研究識別正確的抗體陣列"中了解如何確定用于多重蛋白質檢測的正確抗體陣列。

概括

標準 ELISA、免疫 PCR (IQELISA) 和 SIMOA 相互比較時具有優(yōu)點和缺點：

sELISA是一種簡單的比色測定法，數(shù)據(jù)易于解釋，因此幾乎不需要培訓。使用能夠測量 450 nm 吸光度的酶標儀在 5 小時內獲得數(shù)據(jù)。使用比 IQELISA 和 SIMOA 試劑盒便宜的試劑盒可以靶向數(shù)千種不同的蛋白質。然而，與 IQELISA 和 SIMOA 相比，sELISA 的靈敏度低。
免疫PCR使用實時PCR儀器，在6小時內收集數(shù)據(jù)。在此介紹的三個 ELISA 平臺中，它的體積要求低，但比 sELISA 需要更多的移液和數(shù)據(jù)分析技術專業(yè)知識。平均而言，其靈敏度比 sELISA 高 23 倍。可以同時檢測 3 種蛋白質，但檢測靈敏度會降低。
SIMOA的靈敏度最高，其靈敏度平均分別比 sELISA 和 IQELISA 提高了 465 倍和 63 倍。使用需要專門培訓的昂貴專用儀器可在 3 小時內獲得數(shù)據(jù)。它還需要比 sELISA 和 IQELISA 更多的樣本量。一次可以分析多達 6 種蛋白質，而不會影響靈敏度。

圖 8 表明，對于許多蛋白質，LLOQ 的總體改進遵循以下趨勢：SIMOA > IQELISA > sELISA。不過，也有例外。例如，IQELISA 對人 IL-1β 的靈敏度最高，為 0.0064 pg/ml，而 sELISA 和 SIMOA 的 LLOQ 分別為 0.3 和 0.04 pg/ml。

**圖 8. sELISA、免疫 PCR 和 SIMOA 之間靈敏度倍數(shù)增加的比較。** RayBiotech Life, Inc. 的每個靶標的相同標準品和抗體對用于所有平臺。目標包括 28 種人類蛋白質、3 種小鼠蛋白質和 1 種大鼠蛋白質。**(A)** 17 種蛋白質的靈敏度提高了 0 – 100 倍；不包括(B)或(C)中的蛋白質。**(B)**九種蛋白質的敏感性增加了 0 – 1,000 倍；不包括(A)或(C)中的蛋白質。**(C)**兩種蛋白質的敏感性增加了 0 – 10,000 倍；不包括(A)或(B)中的蛋白質。 Y 軸 = 與 X 軸下方描述的第二 ELISA 平臺相比，第一個 ELISA 平臺的靈敏度增加倍數(shù)。水平線=中位數(shù)。

結論

最常見的蛋白質檢測工具之一是 ELISA。在這里，我們比較了三種流行的夾心 ELISA 平臺：標準 ELISA、免疫 PCR和單分子陣列 (SIMOA)。在為研究選擇合適的 ELISA 時，其底物、檢測方法、儀器、樣品量、靈敏度和成本是重要的考慮因素。標準 ELISA 是流行的方法，因為可以使用低成本試劑盒來靶向來自多個物種的數(shù)千種不同蛋白質。此外，它幾乎不需要培訓即可運行，其數(shù)據(jù)易于解釋，并且使用非專用酶標儀與其他測定兼容。一個關鍵要點是 ELISA 靈敏度和成本之間需要權衡：靈敏度越高，成本越高。成本考慮了套件、培訓、勞動力和所需儀器的價格。因此，sELISA 是實惠的選擇，而 SIMOA 是最敏感的。

對于不具備必要的專業(yè)知識或設備來使用此處討論的 ELISA 平臺分析樣品的實驗室，RayBiotech Life, Inc. 提供完整的測試服務。該服務提供完整的報告，包括原始數(shù)據(jù)、標準曲線和定量數(shù)據(jù)。蛋白質濃度。

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